Impression 3D de composites à base de nanocristaux de cellulose pour construire des échafaudages biomimétiques robustes pour l'ingénierie des tissus osseux

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21244 (2022) Citer cet article

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Les nanocristaux de cellulose (CNC) attirent de plus en plus l'attention dans les domaines de la biomédecine et des soins de santé en raison de leur durabilité, de leur biocompatibilité, de leur biodégradabilité et de leurs excellentes propriétés mécaniques. Ici, nous avons fabriqué à l'aide de la technologie de modélisation par dépôt fusionné des échafaudages composites 3D à partir d'acide polylactique (PLA) et de CNC extraits de Ficus thonningii. La microscopie électronique à balayage a révélé que les échafaudages imprimés présentent des pores interconnectés avec une taille moyenne estimée des pores d'environ 400 µm. L'incorporation de 3 % (p/p) de CNC dans le composite a amélioré les propriétés mécaniques du PLA (module de Young augmenté d'environ 30 %) et la mouillabilité (angle de contact avec l'eau diminué d'environ 17 %). Le processus de minéralisation des échafaudages imprimés utilisant un fluide corporel simulé a été validé et la nucléation de l'hydroxyapatite confirmée. De plus, des tests de cytocompatibilité ont révélé que les échafaudages PLA et CNC à base de PLA sont non toxiques et compatibles avec les cellules osseuses. Notre conception, basée sur l'impression 3D rapide de composites PLA/CNC, combine la capacité de contrôler l'architecture et d'améliorer les propriétés mécaniques et biologiques des échafaudages, ce qui ouvre des perspectives d'applications en ingénierie tissulaire osseuse et en médecine régénérative.

Le développement de matériaux pour l'ingénierie osseuse reste un défi en raison de la complexité de la structure osseuse naturelle et de l'environnement biomécanique. Pour réparer le tissu osseux endommagé, des autogreffes de différents os sont récoltées et utilisées pour remplacer les os manquants. Les allogreffes moins disponibles sont décourageantes1,2,3 et les jonctions artificielles utilisées comme implants doivent souvent être retirées après la cicatrisation4. Récemment, de nouvelles stratégies de réparation osseuse sont apparues, notamment la médecine régénérative assistée par échafaudage utilisée pour favoriser la croissance osseuse5.

Un échafaudage osseux idéal devrait être une matrice tridimensionnelle capable d'imiter la composition et la structure complexes de l'os pour la fixation et la prolifération des cellules6. Par conséquent, il nécessite une biocompatibilité élevée, une biodégradabilité, une non-toxicité, d'excellentes propriétés mécaniques et une architecture appropriée en termes de porosité et de tailles de pores pour s'intégrer au tissu hôte natif7. La composition chimique et les caractéristiques physico-chimiques de l'échafaudage, influençant directement les performances mécaniques et biologiques8, sont donc des paramètres importants à étudier.

Les biopolymères synthétiques ont été largement utilisés dans l'ingénierie des tissus osseux en raison de leur biocompatibilité et de leur capacité à contrôler les propriétés physicochimiques de l'échafaudage. Ils sont constitués de polyesters aliphatiques tels que l'acide polyglycolique (PGA), la polycaprolactone (PCL) et l'acide polylactique (PLA)9. Malheureusement, ils sont plutôt fragiles et perdent généralement leur résistance en raison d'une dégradation rapide in vivo. De plus, leur nature hydrophobe entrave la fixation et la prolifération des cellules osseuses10. Pour pallier ces limitations, les échafaudages à base de polymères synthétiques, à savoir le PLA ou le PCL, peuvent être améliorés en incorporant des renforts polymères naturels tels que la cellulose11,12,13,14,15, l'alginate16, la gélatine17, le chitosane18,19 ou la kératine20 connus pour leurs caractéristiques intéressantes.

Plusieurs techniques, y compris la coulée de solvant et la lixiviation des particules, la lyophilisation en émulsion, la séparation de phase ou l'électrofilage21,22,23, sont utilisées pour développer des échafaudages pour l'ingénierie des tissus durs. Cependant, ils ne permettent pas un contrôle efficace de la morphologie et de la porosité.

La fabrication additive s'est avérée être une technique de choix pour concevoir et préparer des matériaux de réparation osseuse biomimétiques. Les architectures d'échafaudage contrôlées en 3D affectent de manière significative les propriétés mécaniques ainsi que l'adhésion et la prolifération des cellules osseuses2,24,25,26,27,28. Par conséquent, divers travaux se sont concentrés sur le développement d'échafaudages imprimés en 3D utilisant diverses technologies, telles que la stéréolithographie, le traçage 3D, le frittage sélectif par laser, la bio-impression et la modélisation par dépôt de fusion (FDM). Le FDM est la technologie de fabrication additive la plus utilisée. C'est une technique simple et rapide à faible coût offrant de grandes possibilités de manipulation des polymères.

Plusieurs études ont étudié le renforcement du PLA avec des nanomatériaux tels que l'oxyde de graphène29, les nanocharges de nitrure de bore (BN)21, la nano-hydroxyapatite30,31,32 pour améliorer les propriétés mécaniques et bioactives de l'échafaudage polymère. La cellulose est un matériau prometteur pour les applications biomédicales, y compris l'ingénierie tissulaire, la recherche sur les cellules souches et la médecine régénérative33,34,35,36,37 en raison de son excellente biocompatibilité, de sa biodégradabilité favorable, de ses bonnes propriétés mécaniques, de sa surface spécifique élevée, de sa faible densité et de sa non- nature abrasive38,39,40,41. En particulier, les nanocristaux de cellulose (CNC) sont efficaces pour être appliqués comme agents de renforcement ou nanocharges dans la conception d'échafaudages et les résultats ont confirmé que les CNC améliorent considérablement les performances mécaniques et la cytocompatibilité des échafaudages38,39,42,43. De plus, les CNC ont de nombreux groupes hydroxyle qui peuvent former des liaisons hydrogène intermoléculaires avec des groupes carbonyle de PLA pour obtenir une adhérence interfaciale favorable. Le mélange de PLA avec des biopolymères tels que la cellulose améliore les propriétés du PLA sans altérer sa biocompatibilité. Les composites PLA/cellulose ont été largement développés et des études sur les propriétés structurelles, thermiques et mécaniques ont été rapportées12,44,45,46,47,48,49,50,51. Cependant, même si les nanocomposites de PLA et de cellulose sont rapportés dans la littérature pour des applications d'ingénierie tissulaire, nous pensons qu'il reste encore de la place pour développer des échafaudages 3D pour l'ingénierie tissulaire par FDM qui est une technique de fabrication additive rapide et peu coûteuse notamment pour surmonter certaines limitations. rencontrées dans le PLA, à savoir la résistance mécanique du biopolymère.

Ce travail vise donc à démêler l'effet du contenu CNC sur les échafaudages PLA/CNC traités par FDM et son influence sur les propriétés structurelles, de surface et mécaniques finales des biocomposites. Des tests de biominéralisation, de biodégradabilité in vitro et de cytocompatibilité ont été effectués sur le PLA/CNC3 résultant (c'est-à-dire avec 3 % (p/p) de CNC incorporés dans le composite). Le matériau résultant est un échafaudage amélioré mécaniquement qui offre de grandes opportunités pour la conception et la production rapide d'échafaudages 3D biomimétiques avec des propriétés biologiques appropriées.

Les images de microscopie électronique à balayage (SEM) rapportées sur la figure 1 montrent clairement des filaments de PLA pur avec une surface lisse et régulière tandis que ceux des composites sont rugueux en raison de la formation d'agrégats liés à la présence de CNC. En effet l'évolution de la surface du PLA, après l'incorporation du CNC, d'un état lisse à un état rugueux pourrait suggérer une bonne dispersion du CNC sur toute la surface du PLA. L'incorporation de plus de 3% (w/w) de CNC entraîne la formation de grosses particules, ce qui pourrait conduire à moins de liaisons hydrogène entre la matrice (PLA) et le renfort (CNC). En effet, la dispersion des CNC dans le PLA est faible en raison de la nature hydrophile de la cellulose versus la nature hydrophobe du PLA rendant difficile leur interaction et leur dispersion uniforme52.

Images MEB de filaments composites PLA et PLA/CNCx extrudés.

Les filaments composites, issus de l'hybridation de PLA, présentent de bonnes capacités d'amélioration de la liaison et de la prolifération cellulaire. A cet égard, les composites PLA/CNC sont de bons candidats pour des applications biomédicales, notamment dans la régénération osseuse. En effet, les charges de cellulose (CNC) pourraient créer d'importants sites d'attachement et de prolifération cellulaire pour tout matériau d'échafaudage implantable dans l'ingénierie des tissus durs. Plusieurs études ont déjà été menées pour développer des filaments composites PLA/CNC par extrusion monovis imprimables par FDM52,53,54. Cependant, le développement de filaments PLA/CNC pour la production d'échafaudages hybrides pour des applications biomédicales reste nouveau à notre connaissance.

L'analyse par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) des filaments est illustrée à la figure S1 dans les informations supplémentaires. Nos résultats montrent une légère augmentation des intensités de pointe avec l'augmentation de la charge CNC dans la matrice PLA, ce qui est en accord avec la littérature52. Les différences les plus significatives ont été observées à 2946, 1743 et entre 1500 et 1000 cm−1 qui sont respectivement attribuées à l'étirement des liaisons CH, C=O, à la vibration d'étirement du carbonyle (C=O) et au CO du PLA55.

La décomposition des filaments CNC, PLA et des composites dérivés a été examinée à partir des courbes d'analyse thermogravimétrique (TGA), de thermogravimétrie dérivée (DTG) et de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) rapportées à la Fig. 2. Une légère perte de poids est observée entre 100 et environ 325 ° C dans tous les échantillons en raison de la déshydratation des filaments et de la dépolymérisation du PLA ainsi que de la rupture des liaisons glycosidiques dans la cellulose. Par rapport au PLA, les composites présentent une perte de poids plus élevée en raison de la nature hygroscopique des composites après incorporation de CNC hydrophile. Par conséquent, lorsqu'ils sont soumis à des contraintes thermiques, les composites libèrent l'humidité absorbée, ce qui entraîne cette perte de poids relativement élevée. De plus, une forte perte de poids se produit à 400 °C probablement liée à la dégradation du PLA et du CNC. Les températures de début de décomposition du CNC et des filaments sont observées à 225, 318,8, 311,8, 325,5 et 320,4 °C pour le CNC, le PLA, le PLA/CNC1, le PLA/CNC3 et le PLA/CNC5, respectivement. Les filaments développés peuvent donc être traités à des températures atteignant 300 °C sans les endommager. Par conséquent, la température d'impression de 200 ° C utilisée dans notre étude semble être optimale pour développer des échafaudages PLA/CNC. Cependant, la CNC n'améliore pas significativement la stabilité thermique du PLA. Par ailleurs, les courbes DTG montrent une baisse de la température maximale de dégradation des composites par rapport à celle du PLA pur. La dégradation maximale du PLA/CNC3 se produit sur une plage de température (T) d'environ 365 à 374 °C, tandis que celle du PLA, du PLA/CNC1 et du PLA/CNC5 se produit à T = 373,39, 370,62 et 369,22 °C, respectivement. En effet, la température de dégradation relativement large du PLA/CNC3 peut être attribuée à la meilleure hybridation du composite reflétée par une meilleure interaction entre 3% de CNC et PLA.

Analyse thermique des filaments extrudés PLA et PLA/CNCx. (a) analyse thermogravimétrique (TGA, sous azote de la température ambiante à 800 °C à une vitesse de chauffe de 10 °C min−1), (b) TGA dérivée (DTG) et (c) calorimétrie différentielle à balayage (courbes DSC, à partir de température ambiante à 250 °C avec une vitesse de chauffe de 20 °C min−1 sous atmosphère d'azote) montrant les Tg, Tcc et Tm du PLA et des nanocomposites.

De plus, l'analyse des courbes DSC (Fig. 2c) de tous les échantillons révèle successivement des changements de stade endothermique (transition vitreuse), suivis d'un pic exothermique dédié à la cristallisation à froid et d'un pic endothermique dû à la fusion. Par rapport au PLA, les filaments composites présentent un déplacement de la transition vitreuse, de la cristallisation à froid et des pics de fusion vers les températures les plus basses. Cela suggère que la CNC a tendance à diminuer les températures de changement d'état du PLA (tableau 1). En effet, la gamme de transition vitreuse s'élargit avec l'augmentation de la charge CNC. Cela suggère que l'ajout de cellulose augmente la cristallinité en raison de la mobilité accrue des chaînes PLA56. Ceci est cohérent avec les calculs du degré de cristallinité présentés dans le tableau 1. L'ajout de 3 % (p/p) de CNC dans la matrice PLA a provoqué une plage de transition vitreuse plus large avec un pic plus faible, ce qui indique une meilleure interaction entre la CNC et le PLA. et pourrait donc refléter une bonne dispersion et une bonne adhérence interfaciale.

Dans les informations supplémentaires, les figures S2 et S3 affichent respectivement l'analyse thermique du CNC et du PLA et du PLA/CNC3 imprimés en 3D, ce qui prouve que le PLA ne présente aucune thermodégradabilité lorsqu'il est imprimé.

Les échafaudages implantables pour les applications biomédicales nécessitent des attributs spécifiques pour exécuter au mieux les fonctions des organes natifs et aider à régénérer les tissus endommagés. Parmi leurs attributs, les propriétés mécaniques restent les plus cruciales pour soutenir le processus de régénération. Plusieurs auteurs ont étudié des échafaudages combinant divers matériaux pour fournir une substitution réussie ou un support mécanique nécessaire pour favoriser la croissance de nouveaux tissus sur les sites de défauts. Or, les propriétés mécaniques des échafaudages hybrides dépendent du mode de fabrication, du contenu, de l'orientation des nanomatériaux, de la nature de la matrice, des interactions entre la matrice polymère et les nanomatériaux, etc21,29,57,58,59, 60.

Différentes compositions de filaments ont été utilisées pour l'impression 3D d'échafaudages PLA/CNC en utilisant FDM comme décrit dans la section expérimentale. L'analyse de l'effet de la cellulose sur le module de Young, la limite d'élasticité et la déformation à la rupture des échafaudages imprimés en 3D a été étudiée et les résultats sont présentés à la Fig. 3. Les échafaudages en PLA ont un module de Young moyen de 2,4 ± 0,1 GPa conformément à la littérature29,61 et un allongement moyen à la rupture de 2,4 ± 0,3 % tandis que le module de Young moyen et l'allongement à la rupture des composites varient entre 2–3 GPa et 2–3,6 %, respectivement. Ceci est en bon accord avec les propriétés des composites PLA/fibres naturelles62. Il semble que l'ajout de 3% de CNC améliore la résistance mécanique du PLA (p ˂ 0,001). Cette amélioration peut être due à une meilleure hybridation des particules CNC dans les chaînes PLA pour assurer la meilleure compatibilité et absorber toute charge externe. En effet, à concentration relativement faible de renfort cellulosique, les interactions moléculaires entre le PLA et la CNC confèrent une bonne rigidité aux composites. Il en résulte une amélioration du module d'Young63 de 2,4 ± 0,1 GPa pour le PLA à 3,1 ± 0,2 GPa pour le PLA/CNC3 car à de faibles concentrations de CNC les particules ont tendance à s'aligner dans le sens de l'orientation des chaînes de PLA52. Par conséquent, la contrainte appliquée est transférée d'une fibrille à la suivante au sein de la structure composite, permettant ainsi une répartition uniforme de la contrainte dans le matériau. L'amélioration de l'allongement à la rupture et des forces de déformation à la rupture des composites à renfort cellulosique ≤ 3% suggère que la présence de CNC tend à améliorer l'élastoplasticité du PLA. Cela pourrait résulter de la bonne interaction fibre-matrice due à un meilleur emboîtement du réseau CNC dans la matrice PLA. L'incorporation de 5% de CNC a tendance à former de grosses particules réparties dans le composite, ce qui se traduit par la formation de moins de liaisons entre la matrice (PLA) et le renfort (CNC) et une mauvaise compatibilité entraînant de mauvaises performances mécaniques.

Propriétés mécaniques : (a) Photo d'échafaudages en PLA et PLA/CNCx en forme d'os de chien pour les tests de résistance à la traction. (b) Module de Young. (c) Traction limite d'élasticité. (d&e) contrainte à la rupture (***p ˂ 0,001, ** p < 0,01, ns = non significatif).

Sur la base de ces résultats, nous avons concentré les analyses suivantes sur le PLA/CNC3 uniquement. En effet, lorsque la teneur en CNC est supérieure à 3 % (w/w), le PLA ne peut pas suffisamment mouiller la surface de la CNC, ce qui entraîne une forte interaction fibre-fibre et/ou une agglomération de fibres dans la matrice PLA52,54. Cependant, Kumar et al.52 ont trouvé une augmentation de 50 % du module d'élasticité (E) avec 1 % de CNC (4550 MPa) par rapport au PLA pur (3030 MPa). Le module d'élasticité du PLA et de ses composites était meilleur que le nôtre. Néanmoins, on note une diminution de la déformation à la rupture observée pour le CNC 1% (2,8%) par rapport à l'échantillon de PLA pur (8,7%).

La morphologie de surface des échafaudages PLA et PLA/CNC3 a été analysée par MEB, microscopie optique 3D et topographie (Fig. 4). Ces images montrent clairement que l'échafaudage en PLA a une surface lisse tandis que celle du PLA/CNC3 est rugueuse en raison de la présence de cellulose. Idéalement, les échafaudages imprimés devraient avoir des pores de même taille. Cependant, l'analyse des images SEM (Fig. 4) révèle que la taille des pores de l'échafaudage hybride (PLA/CNC3) a augmenté tandis que la largeur des tiges a diminué de manière similaire à ce qui est rapporté dans la littérature21,29. Dans notre travail, la taille moyenne des pores et la largeur de la tige des échafaudages PLA et PLA/CNC3 sont respectivement évaluées à (362 ± 19 µm et 458 ± 17 µm) et (450 ± 15 µm et 337 ± 30 µm). Cette variation de la morphologie de la surface de l'échafaudage peut être attribuée à la modification du comportement rhéologique de la matrice par l'ajout de CNC. En effet, l'ajout de CNC pourrait limiter le comportement élastique du PLA et donc lui donner de la stabilité pour conserver sa forme lors du dépôt. Cependant, le renfort produit une instabilité du flux de matière lors de l'impression affectant probablement la qualité et la résolution.

Micrographies électroniques à balayage d'échafaudages imprimés en 3D : Vue de dessus de la morphologie de (a) PLA et (c) PLA/CNC3. Coupe transversale avec un zoom en médaillon de (b) PLA et (d) PLA/CNC3. ( g ) Analyse statistique des diamètres PLA et PLA / CNC imprimés en 3D observés au-dessus des échantillons par SEM (Test Anova, ** p <0, 01). Topographie d'échafaudages imprimés en 3D montrant généralement la rugosité de surface de (e) PLA et (f) PLA/CNC3.

De plus, la porosité est l'un des paramètres les plus critiques pour évaluer l'efficacité et l'applicabilité des échafaudages biomédicaux, en particulier dans l'ingénierie des tissus osseux, l'administration de médicaments, etc. Une porosité élevée favorise la libération efficace de biofacteurs, y compris les cellules, les gènes et les protéines et fournit un environnement propice à l'échange de nutriments64,65. La porosité des échafaudages PLA et PLA/CNC3 est relativement élevée (58 ± 2 % et 67 ± 2 %), respectivement. L'ajout de 3 % de CNC augmente la porosité des échafaudages en PLA (**p ˂ 0,01), ce qui peut être attribué à l'interaction ionique entre les différents composants créant plus de vides dans les échafaudages. Avec de tels profils de porosité, les échafaudages imprimés pourraient aider à améliorer la croissance osseuse en permettant une vascularisation optimale, la nucléation de l'hydroxyapatite et la maturation minérale66,67.

L'hydrophilie est une propriété qui affecte de manière significative l'adhérence, la prolifération cellulaire et la capacité de réhydratation des échafaudages ; par conséquent, il apparaît crucial pour la performance des échafaudages pour toute application en ingénierie tissulaire, y compris la régénération osseuse. Ainsi, la réactivité et l'interaction entre les échafaudages imprimés et la surface environnante pourraient être prédites en mesurant l'angle de contact et en étudiant le gonflement dans l'eau. La figure S4 (voir Informations supplémentaires) illustre les angles de contact avec l'eau des échafaudages PLA et PLA/CNC3 et les valeurs sont présentées dans le tableau 2. La CNC apporte un caractère hydrophile à la surface hydrophobe des échafaudages PLA en raison du réarrangement de la CNC dans la matrice PLA. . Pour mieux comprendre l'effet de la charge de cellulose sur l'hydrophilie du PLA, nous avons évalué le taux d'absorption d'eau des échafaudages (tableau 2). L'ajout de CNC entraîne une amélioration de l'absorption d'eau du PLA en fonction des résultats de l'angle de contact et de la rugosité de surface des échafaudages. Des résultats de rétention d'eau similaires ont été observés par Murphy et al.56 sur des filaments PLA et PLA/cellulose. Ils ont révélé une augmentation significative de l'absorption d'eau pendant les premières 24h suivie d'une stabilisation pour atteindre progressivement un plateau (1,2% pour le filament PLA et 1,4% pour le filament composite PLA/cellulose).

Au vu de ces résultats, les échafaudages PLA/CNC sont capables de créer un environnement favorable à la prolifération cellulaire et apparaissent donc comme les composites de choix pour la régénération osseuse.

La dégradation enzymatique des échafaudages biomédicaux est régulièrement examinée en déterminant la perte de poids. Dans notre étude, les échafaudages PLA et PLA/CNC3 ont été soumis à une étude de dégradation in vitro en les immergeant dans un tampon alcalase sur une période de 28 jours. Selon les résultats présentés à la Fig. 5, il apparaît que l'échafaudage PLA a une dégradation plus lente par rapport au composite PLA/CNC3. En effet, le PLA et le PLA/CNC3 ont des taux de dégradation évalués respectivement à 1,7 ± 0,3% et 3,9 ± 0,1% après 28 jours d'immersion dans le tampon alcalase. Ils sont donc considérés comme stables. L'incorporation de CNC dans la matrice PLA améliore relativement la dégradation du PLA. Par rapport aux études de Belaid et al.29 sur les échafaudages composites PLA et oxyde de graphène (PLA/GO), le chargement CNC conduit à une amélioration modérée du taux de dégradation des échafaudages PLA dans le tampon alcalase. Ainsi, les CNC apparaissent comme un renfort approprié du PLA. Par conséquent, le biocomposite PLA/CNC peut être conçu comme un matériau potentiel pour développer des échafaudages pouvant être utilisés comme substituts temporaires, en particulier pour la régénération du tissu osseux. Les composites PLA/CNC pourraient présenter des propriétés transitoires favorables en se résorbant au fil du temps pour fournir de l'espace au tissu osseux nouvellement développé qui remplacera l'échafaudage dans le corps.

Perte de poids des échafaudages PLA et PLA/CNC3 en fonction du temps de dégradation (échafaudages immergés dans un tampon alcalase sur une période de 28 jours). (**p ˂ 0,01 et ***p ˂ 0,001 en utilisant une analyse de test t non apparié).

Le processus de minéralisation biomimétique des échafaudages imprimés en SBF a été choisi pour évaluer la formation d'apatite à la surface du PLA et du PLA/CNC3 afin de conclure sur leur régénération osseuse et leur capacité de liaison. La figure 6 montre des images SEM de la surface des échafaudages PLA et PLA/CNC3 après 14 jours d'incubation dans la solution SBF. Le processus de croissance minérale à la surface des échafaudages a été réalisé avec succès en formant un revêtement bioactif. Pour tous les échantillons, on observe clairement la formation d'une couche minérale inhomogène, reflétée par la répartition irrégulière d'agrégats de nanocristaux à la surface, dont la taille et la densité sont dépendantes du temps d'incubation et de la composition de l'échafaudage. Plusieurs auteurs ont observé des résultats similaires68,69,70,71,72,73. Les particules minérales nucléées à la surface des échafaudages ont un aspect de tige. La minéralisation des cristaux d'apatite dépend du pH du milieu, de l'adsorption et de la libération d'ions à l'interface et de la mouillabilité de surface71. Dans l'ensemble, la minéralisation augmente avec le temps d'incubation et est plus grande et plus rapide pour les échafaudages PLA/CNC3. En effet, le dépôt d'apatite à la surface du PLA est relativement lent du fait de son hydrolyse lente en solution SBF69. L'hydrolyse du PLA dans une solution SBF peut prendre plusieurs semaines pour former de nouveaux groupes carboxyle (–COOH) et hydroxyle (–OH) à sa surface. Ensuite, les groupes carboxyle subissent une dissociation partielle pour donner des ions carboxylate (COO-) sur la surface provoquant sa charge négative. La forte interaction électrostatique entre les ions COO− et Ca2+ ainsi que les fortes liaisons hydrogène entre les groupes carboxyle et les ions PO43− piloteront alors le processus d'accumulation des ions calcium Ca2+ et phosphate PO43−69,74.

Évaluation de la croissance de l'apatite sur des échafaudages PLA et PLA/CNC3 minéralisés en SBF à 14 jours par microscopie électronique à balayage à haut et bas grossissement (SEM) pour valider la formation de la couche inorganique et par cartographie élémentaire pour montrer la présence et la distribution homogène de les éléments phosphate et calcium qui constituent l'apatite. (a) Images SEM et cartographie élémentaire de PLA, (b) Images SEM et cartographie élémentaire de PLA/CNC3.

D'autre part, nous pourrions supposer que l'ajout de CNC à la matrice PLA pourrait modifier le processus de formation de la couche minérale en raison de l'hydrophilie résultant de la formation de groupes hydroxyle supplémentaires sur la surface PLA. Ces groupes fonctionnels jouent un rôle important dans l'échange d'ions entre la surface et le liquide environnant et dans le dépôt d'apatite sur l'échafaudage. En effet, ces groupements hydroxydes apportent des charges négatives supplémentaires à la surface de l'échafaudage pour interagir avec les ions Ca2+ et PO43− du SBF favorisant ainsi l'adsorption et la nucléation de l'apatite68,71,75,76. Au vu de ces résultats, les composites PLA/CNC sont de bons candidats pour soutenir la formation d'apatite et contribuent donc à la régénération et à la liaison osseuses en fournissant un microenvironnement pratique pour la croissance cellulaire et la fonction de réparation.

La biocompatibilité de l'échafaudage PLA/CNC a été étudiée à l'aide d'ostéoblastes humains hFOB1.1977. Par rapport aux cellules témoins non traitées (Ctrl), l'incubation avec des filaments PLA et PLA/CNC3 n'a montré aucun effet inhibiteur sur la viabilité cellulaire au jour 5 (Fig. 7a), confirmant que PLA et CNC sont cytocompatibles.

Cytocompatibilité des filaments et échafaudages PLA et PLA/CNC. ( a ) Effet des filaments PLA ou PLA / CNC3 sur la viabilité des ostéoblastes humains hFOB au jour 5 de la culture. ( b ) Microscopie électronique à balayage montrant des cellules hFOB cultivées sur les échafaudages PLA (panneau de gauche) et PLA / CNC3 (panneau de droite) (barre d'échelle = 200 µm). ( c ) Croissance de cellules hFOB luminescentes sur les échafaudages PLA et PLA / CNC3 aux jours 1, 2 et 4. ( d ) Expression de gènes marqueurs de différenciation ostéogénique sur des cellules hFOB cultivées pendant 2 jours en présence d'éluats PLA et PLA / CNC3. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test de Mann-Whitney entre PLA et PLA/CNC3 (ns, non significatif ; ***, p < 0,001).

Pour déterminer que les cellules osseuses étaient capables d'adhérer et de proliférer sur les échafaudages correspondants, nous avons effectué une microscopie électronique à balayage après avoir ensemencé la cellule hFOB sur les échafaudages. Comme le montre la figure 7b, les cellules hFOB se sont complètement propagées sur les échafaudages PLA et PLA / CNC3 et ont présenté une morphologie normale. De plus, nous avons également ensemencé des cellules hFOB bioluminescentes (lignée cellulaire ostéoblastique) sur les échafaudages et surveillé leur croissance au fil du temps. Après 6 jours, les ostéoblastes prolifèrent de manière significative sur les deux échafaudages et aucune différence significative n'a été observée sur l'échafaudage PLA / CNC3 par rapport au PLA (Fig. 7c). Enfin, nous évaluons l'effet du PLA et du PLA/CNC3 sur la différenciation hFOB en mesurant par RT-QPCR l'expression de gènes (ALP, RUNX2 et OCN) utilisés comme marqueurs de la différenciation osseuse. Comme le montre la figure 7d, le niveau d'expression des 3 gènes était plus élevé en présence de PLA/CNC3 qu'en présence de PLA seul. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que les échafaudages PLA/CNC3 soutiennent pleinement la croissance des cellules osseuses et sont biocompatibles.

Dans l'ensemble, notre approche dans la conception d'échafaudages biomimétiques 3D pour l'ingénierie des tissus osseux est en accord avec les enquêtes précédentes démontrant que le renforcement du PLA avec des nanomatériaux améliore les propriétés biologiques et mécaniques du matériau21,29. Néanmoins, les nanocharges existantes sont synthétiques et pourraient déclencher des effets indésirables si elles s'accumulent dans les tissus. Ici, un biopolymère naturel avec des réponses biologiques pertinentes, c'est-à-dire la CNC, incorporé dans la matrice PLA à une quantité optimale, améliore considérablement la résistance mécanique de l'échafaudage sans altérer la porosité et la structure accordables. Il s'agit d'un paramètre clé pour obtenir une fonctionnalité optimale des échafaudages tissulaires biomimétiques de pointe.

Des échafaudages en PLA renforcés de nanocristaux de cellulose ont été conçus et fabriqués avec succès à l'aide de la technologie FDM. Leur structure, leur surface, leurs propriétés morphologiques et mécaniques ont été évaluées ainsi que leurs performances biologiques. Les échafaudages cellulaires 3D sont hautement poreux avec la présence évidente d'une architecture poreuse répétitive interconnectée favorable à l'amélioration de la croissance du tissu osseux en permettant une vascularisation optimale, la nucléation de l'hydroxyapatite et la maturation minérale. Une incorporation de 3% (p/p) de CNC dans le composite augmente les propriétés mécaniques du PLA et la rugosité de surface, tout en contribuant à l'amélioration de la mouillabilité par une transition de surface du PLA d'hydrophobe à hydrophile. Le processus de minéralisation des échafaudages imprimés utilisant un fluide corporel simulé et la nucléation de l'hydroxyapatite ont été confirmés. Enfin, les composites PLA/CNC sont apparus parfaitement compatibles avec les ostéoblastes humains et ont permis leur adhésion et leur prolifération. Nos résultats mettent en lumière la pertinence de la CNC dans les composites à base de PLA pour l'ingénierie tissulaire et ouvrent des voies simples et prometteuses pour concevoir des échafaudages multifonctionnels imprimés en 3D qui sont actifs pour les futures applications de régénération tissulaire.

Les granulés d'acide polylactique (PLA) ont été achetés auprès de NatureWorks LLC. Dichlorométhane (CH2Cl2, < 99,7 %, CAS 75-09-2, Sigma-Aldrich), hydroxyde de sodium (NaOH, pastilles, 98,9 %, Sigma-Aldrich), acide sulfurique (H2SO4, 95,0–98,0 %, CAS 7664-93- 9, Sigma-Aldrich), peroxyde d'hydrogène (H2O2, 30 % (p/p), CAS 7722-84-1, Sigma-Aldrich), éthanol (96 % vol, CAS 64-17-5, Sigma-Aldrich), chlorure de sodium (NaCl, ≥ 99 %, CAS 7747-14-5, Sigma-Aldrich), hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3, ≥ 99,7 %, CAS 144-55-8, Sigma-Aldrich), chlorure de potassium (KCl, ≥ 99 ,7%, CAS 7447-40-7, Sigma-Aldrich ), hydrogénophosphate dipotassique trihydraté (K2HPO4.3H20, ≥ 99%, CAS 16788-57-1, Sigma-Aldrich) chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2.6H2O, ≥ 99 %, CAS 7791-18-6, Sigma-Aldrich), chlorure de calcium (CaCl2, ≥ 97 %, CAS 10043-52-4, Sigma-Aldrich), sulfate de sodium (Na2SO4, ≥ 99,0 %, CAS 7757-82 -6, Sigma-Aldrich), Tris-hydroxyméthyl aminométhane ((HOCH2)3CNH2) (tris), ≥ 99,8 %, CAS 1185-53-1, Sigma-Aldrich), acide chlorhydrique (HCl, 36 % CAS 7647-01- 0, Sigma-Aldrich), Bacillus licheniformis (alcalase, CAS 126741 Sigma-Aldrich), L-cystéine (CAS,52-90-4 ), Azide de sodium (CAS 26628-22-8, Sigma-Aldrich), tampon TRIS pH 9.0 (CAS 77-86-1, Alfa Aesar), diméthylsulfoxyde (DMSO, CAS 23486.297 ; BDH Prolab), milieu Eagle modifié α de Dulbecco (DMEM/F12, CAS 10565018 ; Gibco)), bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT, 98 %, CAS 298- 93-1, Sigma-Aldrich), du sérum fœtal bovin (FBS, CVFSVF00-01 ; Eurobio), de la trypsine-EDTA (CAS 25300-054 ; Gibco), de l'hexaméthyldisilazane (CAS 999-97-3, Sigma-Aldrich), ont été obtenus et utilisé sans autre purification. La lignée cellulaire ostéoblastique hFOB obtenue auprès de l'ATCC a été utilisée pour l'analyse de cytocompatibilité.

Des nanocristaux de cellulose (CNC) ont été synthétisés à partir de Ficus thonningii (FT) par une méthode en trois étapes basée sur (1) un traitement alcalin, (2) un blanchiment et (3) une hydrolyse acide comme proposé par Dingyuan Zheng78 avec des modifications. En bref, les fibres brutes FT, préalablement séchées et stockées à 70 ° C, ont été coupées, broyées puis dispersées dans une solution alcaline d'hydroxyde de sodium (NaOH, 0, 5 N) avec un rapport fibres FTF / NaOH sur solution de 3 g / 80 mL. Ils ont été agités en continu à 100°C pendant 4h. Après le traitement alcalin, les fibres ont été filtrées, lavées avec de l'eau MilliQ 18 M jusqu'à neutralisation du pH. Les fibres résultantes ont été blanchies avec du peroxyde d'hydrogène (H2O2) pendant 1 h à 80 °C. La séquence de blanchiment a été répétée plusieurs fois pour obtenir des fibres d'un blanc éclatant. Enfin, la synthèse de nanocellulose a été réalisée par le procédé d'hydrolyse acide suivi d'une sonication par ultrasons. Dans le détail, 10 g de fibres blanchies ont été dissoutes dans 200 g d'une solution aqueuse d'acide sulfurique (64%) sous agitation magnétique pendant 1h30 à 45°C. Ensuite, la suspension obtenue a été filtrée, lavée plusieurs fois avec de l'eau MilliQ 18 M puis a été soumise à une dialyse pendant 7 jours (dans des poches de dialyse de 12 000 à 14 000 Da). Après dialyse, la solution résultante a été soniquée dans un bain de glace à l'aide d'un homogénéisateur à ultrasons (BANDELIN electronic, GM 3100) équipé d'une pointe de sonde de 7 cm. La plage de fonctionnement de l'homogénéisateur à ultrasons a été fixée à 50 %. La suspension résultante a été centrifugée à 10 000 rpm pendant 30 min et la pâte a été congelée, lyophilisée puis broyée à l'aide d'un mélangeur Moulinex (LM935) à 8 000 rpm pendant 3 min pour obtenir une poudre blanche de nanocristaux de cellulose (CNC). La figure S5 résume les étapes de la synthèse des nanocristaux de cellulose à partir de la tige FT (voir informations supplémentaires).

Afin de produire des filaments composites PLA/CNC homogènes par extrusion monovis, nous avons initialement proposé de formuler des composites en incorporant des charges de nanocellulose dans la matrice PLA par dissolution chimique. 30 g de PLA ont été dissous dans 200 mL de dichlorométhane (DCM) à température ambiante sous agitation magnétique continue suivie d'une sonication dans un bain de glace pendant 5 min. Ensuite, la suspension de CNC/DCM a été ajoutée à celle de PLA pour donner des bouillies de mélange de PLA/CNC/DCM avec 0, 1, 3 et 5 % (p/p) de CNC par rapport au PLA (tableau 3). Les suspensions PLA/CNC/DCM obtenues ont été soniquées dans un bain de glace à l'aide d'un homogénéisateur à ultrasons pendant 15 min et maintenues sous agitation magnétique continue à température ambiante pendant 24 h pour assurer une bonne homogénéisation. Ils ont ensuite été laissés sécher une nuit à température ambiante, puis coupés en petits morceaux et séchés sous vide pendant 24 h pour assurer un séchage complet. Les polymères composites séchés résultants ont été extrudés à l'aide d'une extrudeuse monovis Noztek modèle MHB26234 à une température comprise entre 160 et 165 °C. Ils ont ensuite été refroidis par conversion en sortie de buse à l'aide du ventilateur de l'extrudeuse pour donner des filaments hybrides PLA/CNC notés PLA/CNCx, où x correspond à la teneur en CNC. Enfin, des filaments d'environ 1,75 ± 0,05 mm de diamètre ont été sélectionnés pour l'impression 3D. Les filaments de PLA pur ont été produits par extrusion directe à partir de pelles de PLA dans les mêmes conditions que les filaments composites. La figure 8 résume la préparation des filaments composites PLA/CNC. La séquence d'extrusion a été répétée 2 à 3 fois pour obtenir des filaments PLA/CNCx de diamètres homogènes. L'échafaudage a été modélisé par conception assistée par ordinateur (CAO) à l'aide du logiciel Design Spark Mechanical, traduit en fichier STL et tranché par le logiciel Prusa3Dslicer pour générer le code G. Enfin, les dessins cylindriques (poreux) (diamètre (10 mm) × hauteur (2 mm)) et les pièces rectangulaires (dense) ont été conçus à l'aide d'une imprimante modèle FDM Prusa MK2S Research équipée d'une buse de 0,4 mm de diamètre à 200 °C. Les filaments ont été déposés avec une architecture de remplissage rectiligne dans des directions précises de 0° et 90° entre deux couches successives. L'épaisseur de chaque couche était de 0,15 mm avec 80 % de remplissage pour les cylindres et 100 % de remplissage pour les pièces rectangulaires et la vitesse d'impression était de 30 mm/s.

Étapes de fabrication de l'échafaudage PLA/CNCx (extrusion du filament composite et impression 3D).

Les composites PLA et PLA/CNCx ont été examinés à l'aide d'un calorimètre différentiel à balayage (DSC) (Q20, instruments TA), équipé d'un système de refroidissement RCS90 (instruments TA). Les échantillons ont été pesés dans un bac TA en aluminium et scellés. Une casserole scellée vide a été utilisée comme référence. Les échantillons ont d'abord été refroidis à 25 °C puis chauffés à 250 °C avec une vitesse de chauffage de 20 °C min-1 sous atmosphère d'azote. Les propriétés thermiques des composites PLA et PLA/CNCx telles que la température de transition vitreuse (Tg), la température de cristallisation à froid (Tcc), la température de fusion (Tm) et l'enthalpie de fusion (ΔHm) ont été évaluées par les balayages de chauffage. Le degré de cristallinité (\({\chi }_{c}\)) a été déterminé à la fois pour le pic de cristallisation à froid et le pic de fusion à l'aide des équations suivantes56 :

où ΔHcc est l'enthalpie de cristallisation à froid, W est la fraction pondérale de PLA dans l'échantillon et ΔHm0 est l'enthalpie de fusion pour le matériau PLA cristallin à 100%, qui a été prise comme 93 J g-1. L'analyse thermogravimétrique (TGA) a été réalisée à l'aide d'un appareil TGA Q500 (TA instruments). 10 mg de chaque échantillon ont été chauffés sous azote de la température ambiante à 800 °C à une vitesse de chauffage de 10 °C min-1.

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a été réalisée en mode de réflectance totale atténuée (ATR-FTIR) sur un spectromètre modèle NICOLET NEXUS. Tous les spectres ont été enregistrés dans une gamme spectrale de 4000 à 650 cm-1 avec une accumulation de 32 scans à une résolution de 4 cm-1.

La morphologie des CNC, des PLA extrudés et des filaments composites ainsi que des échafaudages imprimés en 3D a été observée à l'aide de la microscopie électronique à balayage HITACHI S4800. Les échantillons ont été recouverts de platine pendant 30 s à l'aide d'un Polaron SC7620 Mini Sputter Coater pour l'analyse SEM. Le logiciel Image J a été utilisé pour calculer le diamètre moyen du filament en prenant la moyenne à 20 points et la taille des pores en prenant la moyenne de 8 pores, ce qui est noté moyenne ± écart type. La topographie des surfaces des échafaudages a été analysée à l'aide d'une microscopie optique 3D (Keyence) et d'un testeur de rugosité chromatique confocal (STIL SA) équipé d'un capteur CHR1000.

La porosité de l'échafaudage a été obtenue par une méthode de déplacement de liquide telle que rapportée dans la littérature64. En bref, les échafaudages ont été immergés dans des tubes contenant une quantité spécifique d'éthanol (W1) pendant 30 min. Ensuite, le poids total des échafaudages immergés et de l'éthanol a été noté W2. Après avoir retiré les échafaudages, l'éthanol résiduel dans les tubes a été noté W3. La porosité des échafaudages a été mesurée selon l'équation suivante :

Les propriétés mécaniques des échafaudages PLA/CNC imprimés en 3D ont été caractérisées à l'aide d'un système de traction (Zwick Roell), couplé à une cellule de charge 5KN. Les spécimens ont été imprimés sous la forme d'un os de chien (40 mm de long, 4 mm de large et 1,5 mm d'épaisseur). Les spécimens ont ensuite été serrés entre des mâchoires dédiées et tirés à une vitesse de 0,05 mm s-1 jusqu'à ce qu'ils se cassent. Le logiciel Zwick Roell est capable de calculer le module d'Young, la force maximale à la rupture et l'allongement à la rupture. Au moins 5 spécimens sont imprimés dans les mêmes conditions afin d'effectuer une mesure statistique.

L'angle de contact des échafaudages imprimés en 3D avec l'eau a été examiné pour déterminer leur hydrophilie à température ambiante en utilisant la méthode de la goutte sessile. Deux échafaudages ont été analysés : le PLA comme référence et le PLA/CNC3 comme composite avec les meilleures performances mécaniques. Les gouttes ont été photographiées à l'aide d'un analyseur Drop Shape - DSA25 équipé d'une caméra monochrome B-CAM-21-BW (CCCIR) et d'une lampe Led R60 (Conrad). En bref, 6 μL d'eau MilliQ 18 M ont été déposés sur la surface de chaque échafaudage et l'angle de contact à l'équilibre (considéré à 60 s) a été enregistré. Les logiciels One Touch Grabber et Image J ont été utilisés pour calculer les angles de contact. Le comportement de gonflement des échafaudages a été déterminé par méthode gravimétrique. Les échafaudages de poids précédemment connu (Wd) sont immergés dans 10 ml d'eau MilliQ 18 M, puis incubés sous agitation continue à 37 oC pendant une durée d'équilibre supposée être de 7 jours. Ensuite, les échantillons ont été retirés de l'eau, nettoyés avec du papier filtre pour éliminer l'excès d'eau résiduelle adsorbée sur la surface et pesés (Wh). Enfin, l'indice de gonflement de l'échafaudage a été déterminé comme suit :

La dégradation enzymatique du PLA et du PLA/CNC3 a été réalisée à l'aide de l'enzyme alcalase selon un protocole précédemment rapporté dans la littérature avec des modifications29,79,80. En effet, des bandes de tissus PLA et PLA/CNC3 (dimensions 5 [L] × 15 [l] × 0,13 [h]) d'environ 0,25 g ont été imprimées et immergées dans 25 mL de tampon TRIS (pH 9,5, 60 °C) avec une concentration optimale de 50 % (p/p) (par rapport au poids du tissu) d'alcalase nécessaire à l'hydrolyse enzymatique, 3 mM de L-cystéine et 0,05 % (p/p) d'azide de sodium (par rapport au poids du Tampon TRIS). La dégradation a été évaluée en déterminant la perte de poids à 4, 7, 14, 21 et 28 jours. Les échantillons ont d'abord été séchés à 105 °C pendant 90 min, refroidis dans un dessiccateur puis pesés dans un flacon de pesée fermé. Le pourcentage de perte de poids a été calculé comme suit :

où W1 et W2 sont le poids sec des échantillons avant et après biodégradation, respectivement.

La lignée cellulaire ostéoblastique hFOB 1.19 (ATCC® CRL11372™, ATCC, USA)77 a été cultivée en utilisant du milieu conditionné DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium α) (Gibco 10565018) additionné de 10 % (V/V) de sérum bovin fœtal (FBS ) (Eurobio CVFSVF00-01). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans 5% de CO2 dans une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre et trypsinisées avec 0, 05% de trypsine-EDTA (Gibco 25300-054). Après stérilisation avec de l'éthanol à 70 % (p/v) pendant 30 min et irradiation UV pendant 1 h, les filaments et échafaudages imprimés ont été séchés à température ambiante puis mis en contact avec des cellules hFOB pendant 5 jours.

La viabilité cellulaire a été analysée à l'aide du test MTT réalisé en incubant 100 µL de 0,5 mg/mL de solution MTT sur les cellules pendant 3 h. Des cristaux de formazan de couleur violette ont été dissous à l'aide de 100 µL de DMSO (BDH Prolab 23486.297) et l'absorbance a été enregistrée à 560 nm à l'aide d'un lecteur de plaques Multiskan (thermos, USA).

Pour les tests d'adhésion, des cellules hFOB 1.19 ont été cultivées sur les échafaudages pendant 4 jours (ensemencement de 2 × 104 cellules par puits de plaque 24 puits contenant l'échafaudage). Les cellules cultivées sur des échafaudages ont été fixées avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 2 h à température ambiante. Les échafaudages avec des cellules ont ensuite été incubés deux fois pendant 15 min à température ambiante, en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 95 % (v/v)), suivies d'éthanol absolu puis d'hexaméthyldisilazane pendant la nuit. Pour les tests de croissance d'échafaudage, des cellules hFOB 1.19 exprimant la luciférase ont été cultivées sur des échafaudages pendant 6 jours (ensemencement de 2 × 104 cellules par puits de plaque à 24 puits contenant l'échafaudage). L'activité luciférase a été quantifiée à l'aide d'un luminomètre après lyse cellulaire. Afin d'étudier uniquement l'influence de la cellulose sur les propriétés biologiques du PLA, un modèle 2D a été utilisé.

Les cellules hFOB 1.19 ont été ensemencées à 500 000 cellules/puits dans des plaques 6 puits à fond plat et incubées à 37°C/5% CO2 pendant 48 h dans 2 ml de milieu préalablement incubés pendant 24 h avec les échafaudages correspondants à 0,2 g/ ml. L'ARN total a été extrait à l'aide du kit EZNA Total RNA Kit I, en suivant les instructions du fabricant. L'ADNc a été synthétisé à partir de 1 µg d'ARN par reverse transcriptase (Mix qScript, Invitrogen Life Technologies). Les réactions de PCR ont été réalisées dans un thermocycleur (LightCycler® 480) pendant 30 cycles. Les amorces utilisées sont fournies dans le tableau 4.

Pour évaluer la bioactivité osseuse, la capacité à former de l'apatite sur des échafaudages PLA et PLA/CNC3 a été étudiée par culture minéralisée in vitro dans un fluide corporel simulé (SBF) selon la méthode décrite dans la littérature81. En bref, les échafaudages ont été immergés dans 10 ml de SBF frais, puis incubés dans un agitateur incubateur thermoplastique à 37 ° C. La solution SBF a été changée tous les deux jours tout au long de la période d'étude de 4 semaines. Après incubation, des échantillons hebdomadaires ont été retirés du liquide et séchés dans un dessiccateur. Enfin, la microscopie électronique à balayage (MEB) et la spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (détecteur : Oxford Instruments X-Max AZTEC, Royaume-Uni ; microscopie : Zeiss EVO HD15, Allemagne) ont été réalisées pour étudier le degré de minéralisation des échafaudages.

Pour la plupart de la méthode de caractérisation quantitative, le test ANOVA a été utilisé pour évaluer si les données de chaque groupe d'échantillons montraient une différence significative (p < 0,05 pour significatif). Pour le test de dégradation, un test t non apparié a été effectué pour comparer les données de PLA à PLA/CNC3. Pour les tests biologiques, le test de Mann-Whitney a été réalisé pour l'analyse statistique.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires).

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Hélène Garay est reconnue pour son soutien dans les analyses topographiques.

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Correspondence to Chrystelle Salameh.

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N'Gatta, KM, Belaid, H., El Hayek, J. et al. Impression 3D de composites à base de nanocristaux de cellulose pour construire des échafaudages biomimétiques robustes pour l'ingénierie des tissus osseux. Sci Rep 12, 21244 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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Reçu : 13 juin 2022

Accepté : 02 décembre 2022

Publié: 08 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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